Hematolojik Tetkiklerin Yorumu ve Standardizasyonu

Dünyada en sık görülen genetik hastalıklar orak hücre anemisi ve beta talasemidir. Bunların yanında alfa talasemi ve hemoglobin varyantları önemli bir yer tutmaktadır. Hemoglobin molekülünü ilgilendiren ve moleküler düzeyde bu kadar farklılık gösteren mutasyonların belirlenmesine yol gösterecek hematolojik testlerin iyi bilinmesi ve hangi sırayı takip ederek moleküler defektin belirlenmesi oldukça önemlidir.  Hematolojik parametrelerin doğru ölçülmediği veya yöntemlerin yetersiz kaldığı durumda mutasyon noktalarını ilgili genleri tarayarak belirlemek çok zaman ve masraf gerektirmektedir. Bu nedenle moleküler patolojinin belirlenmesine ışık tutacak yöntemlerden birinin yetersiz kaldığı durumda hangisinin kullanılacağı, laboratuvarda bulunan cihazlardan en az masrafla nasıl faydalanılacağını bilmemiz zaman ve madde tasarrufu sağlayacaktır.

HEMATOLOJİK YÖNTEMLER

1.KAN SAYIMI

EDTA'lı tüplere toplanan kanlar yavaşça birkaç defa karıştırılarak homojen hale getirildikten sonra otomatik kan sayım cihazında (Coulter T890) hematolojik parametreler (eritrosit ve lökosit sayıları Hb, Hct, MCV, MCH, MCHC) belirlenir. Tarama testlerinde kullanılan hematolojik değerler tablo 22’de gösterilmiştir.

Tablo 22: Hematolojik değerler ve normal sınırları

2.HEMOLİZAT HAZIRLANMASI

Kanlar üç kez serum fizyolojik ile yıkanarak 2400 rp'de 10 dk santrifüj edilir. Çökelen hücre hacmi kadar su ve yarısı kadar da CCl₄ ilave edilerek 5 dakika iyice çalkalandıktan sonra 3000 rpm'de 10 dakika santrifüj edildir. Üst faz izoelektro fokusing (IEF), HbA₂, HbF ve High Performance Liquid Chramatography (HPLC) analizlerinde kullanır (4).

Kontrol hazırlamak için: HbAC, HbSS ve HbF  olduğu bilinen kanlardan hemolizat hazırlanarak Hb konsantrasyonları ölçülür. Örneklerin Hb konsantrasyonu 12 gr/dl olacak şekilde ayarlanır. Her üç hemolizattan eşit hacimde alınarak karıştırıldıktan sonra küçük tüplere bölünerek +4°C'de saklanır (4).

3.HEMOGLOBİN ELEKTROFOREZİ

Elektroforez, genel olarak, bir çözelti içerisindeki elektrik yüklü partiküllerin elektriksel alanda göç ettirilerek ayrıştırılması prensibine dayanan bir analiz yöntemidir. İlk elektroforez uygulaması 1937 yılında Tiselius tarafından proteinleri fraksiyonlarına ayırmak için uygulanmıştır.  Günümüzde halen; amino asitler, peptidler, proteinler ve nükleik asitler gibi biyolojik önemi olan birçok molekülün fraksiyonlarına ayrılmasında kullanılan en yaygın yöntem elektroforezdir.

Yüklü moleküller, çözelti içerisinde ortamın pH'sına bağlı olarak değişmek üzere (+) veya (-) elektrik yüklü birer partikül olarak davranırlar. Elektriksel alanda (+) yüklü partiküller katota (negatif yüklü elektrot), (-) yüklü olanlar ise anoda (pozitif yüklü elektrot) doğru göç ederler. Her elektroforez sistemi üç temel bileşenden oluşur. Bunlar; a) destek ortamı, b) elektroforez tamponu ve c)güç kaynağı ve d) boyamadır.

a)Destek ortamı: Ayrıştırılmak istenen örneğin uygulandığı ve üzerinde veya içerisinde göç ettiği ortamdır. Kullanılan örneğe ve analizin amacına göre farklı fiziksel özelliklere sahip destek ortamları kullanılır. Bunlar arasında en yaygın kullanım alanına sahip olanlar kağıt, nisaşta, agar, poliakrilamit jelleri ve selüloz asetat membranıdır. Destek ortamları (özellikle jel olanlar), malzemesine ve konsantrasyonlarına bağlı olarak çapları değişebilen mikro kanallar (por) içeren birer elek işlevi gösterirler.

Nişasta jel elektroforezi: Nisaşta jel elektroforezi genellikle makromoleküllerin yüklerine ve moleküler büyüklüklerine dayanılarak ayrıştırılmasında kullanılan metottur. Agaroz jelde olduğu gibi hem dikey hem de yatay olarak kullanılabilmektedir. Nişasta jelinin uygun hazırlanışı diğerlerine göre daha zor olması nedeniyle günümüzde yaygın değildir.

Agaroz jel elektroforezi: Agaroz jel elektroforezi destekleyici ortam olarak bileşenleri agaroz ve agaropektin olan agarın kullanıldığı kullanışlı bir yöntemdir.  Agaroz serbest iyonize gruplar içermez iken, agaropektin HSO₄^- ve COOH^- grupları içerir. Agar yerine agarozun tercih edilmesi  proteinlere afinitesinin daha az olması, kurutulduğu zaman doğal olarak şeffaf kalması ve densitometrik inceleme için daha uygun olmasıdır.

Sellüloz asetat elektroforezi: Sellüloz asetat, sellülozun hidroksil gruplarının asetik anhidrid ile işlenerek elde edilmiş bir termoplastik reçinesidir. Ticari olarak elde edilebilen seluloz asetat membranları kullanım öncesinde kuru, opak ve kırılgan olup % 80 hava boşluğu içerirler. Tampon ile ıslatıdığında hava boşlukları tampon ile dolar.  Örnek ıslatılmış membrana bir aplikatör yardımı ile uygulanır. Seluloz asetat elektroforezinin avantajı ayrıştırma hızının yüksek oluşu ve şeffaflaştırılan membranların uzun süre saklanabilmesidir.

Poliakrilamid jel elektroforezi: Bu metodda kullanılan jel bir akrilamid polimeridir. Uzun zincirli moleküller arasında çapraz bağlanmalar gerçekleşir. Elektroforetik ayırımı sağlayan başlıca faktör bileşiklerin büyüklüğü olup, elektrik yüklerinin önemi daha azdır. % 7,5'lik tipik bir poliakrilamid jeli yaklaşık 5nm (50Å) por çapına sahip olup, moleküler elek işlevi gösterir. Büyük bileşikler göç sırasında küçük olanlara göre daha fazla polimerde tutulurlar ve daha yavaş göç ederler.

b)Elektroforez tamponu: Elektroforezde kullanılan tamponların iki görevi vardır; uygulanan akımı taşımak ve elektroforez ortamının pH'sını sabitleyerek ayrıştırılmak istenen partiküllerin elektrik yükünü belirlemektir. Tamponun pH'sı kadar iyonik gücü de önemlidir. Tamponun iyon konsantrasyonu arttıkça iyonik gücü de artar ve yüklü partikülleri çevreleyen iyonik bulutun çapı artar, mobiliteleri azalır. Yüksek iyonik güce sahip tamponlar keskin bant ayırımı sağlar, fakat artan dirence paralel fazla miktarda açığa çıkan ısı yüksek sıcaklığa dayanıksız (ör: protein) moleküllerin denatürasyonuna neden olur.

c)Güç kaynağı: Elektroforez sistemlerine sabit akım veya sabit voltaj sağlamak amacıyla ticari olarak elde edilebilen düşük voltaj güç kaynakları kullanılır (Pharmacia EPS 500/400). Elektroforezde, destek ortam içerisinden geçirilen akım, destek ortamın elektriksel direnci nedeni ile ısı üretimine neden olur. Artan sıcaklık, tamponun buharlaşmasına, iyon konsantrasyonlarının artmasına, destek ortamının kurumasına, ayrıştırılmak istenen protein gibi moleküllerin denatürasyonuna ve destek ortam direncini azaltarak akımın artmasına neden olur. Artan sıcaklık ile doğan bu tür problemler, elektrofrez sisteminden soğuk su (+4°C) dolaşımı ile giderilmeye çalışılır.

c)Fraksiyonların boyanması: Çoğu biyolojik bileşik renkli olmadığı için elektroforez ile ayrıştırma işlemi sonunda fraksiyonların destek ortamı üzerinde yerlerinin belirlenmesi için boyama yapılır. Fraksiyonların belirlenmesinde çeşitli kimyasal maddelerle boyama, enzimatik reaksiyonlar, immunokimyasal reaksiyonlar kullanılır. Elektroforezde yaygın olarak kullanılan  boya maddeleri arasında her tür protein için kullanılan Ponceau S sayılabilir.

Elektroforez:

Prensip:

Alkali pH’da hemoglobin molekülü negatif  yüklüdür ve elektriksel ortamda anoda doğru göç eder. Yüzey yük değişikliği olan yapısal varyantlar ise farklı göç ederler. Alkali ortamda selüloz asetat kağıdı üzerine uygulanan hemolizat elektriksel güç uygulanarak basit ve seri bir şekilde hemoglobin tiplendirilmesi yapılır ve  anormal hemoglobinler tiplendirilebilir(4).

Ayıraçlar:

Katot tamponu pH 8.6 : 5.15 g Na- Barbital, 0.92 g Barbital bir litre redistile suda çözülür.

Anot tamponu pH 9.1: 25.2 g Tris, 2.5 g EDTA, 1.9 g Borik asit  bir litre redistile suda çözülür.

Boya : 500mg Ponceau-S  100ml    %5’lik trikloroasetik asitte çözülür.

Yıkama çözeltisi : Asetik asit %5’lik.

Teknik:

Eşit hacimde anot ve katot tamponu ( 100ml + 100ml ) içerisinde selüloz asetat kağıdı (Sartorious 11200-57-130BBN) ıslatılır. Filtre kağıdının arasında hafifçe kurutularak üzerine hemolizat tatbik edilir. Numune tatbiki katodik yapılır, elektroforez  190-200 Volt veya 0.75 mA/ cm akım 45 dakika süre ile uygulanır. Elektroforez bitiminde kağıtlar 5dk Ponceau S içerisinde boyanır. Boya artıkları %5’lik asetik asit ile temizlenir.  Fraksiyonların miktarlarını bulmak için dansitometrede çizdirilir. Farklı örneklerin Hb elektroforezleri şekil 1’de gösterilmiştir.

Yorum:

Normal yetişkin bir kişide selüloz asetat üzerinde ( pH 8.6; 9.1) yapılan elektroforezde %98 oranında Hb A gözlenir. Hb F %1’in altında olduğu için görülmez. Aplikasyon noktasına yakın bölgede eritrosit membran artıkları ve karbonik anhidraz eser halde izlenebilir. Bu kısımda göç eden Hb A₂ eser miktarda bulunur. Kordon kanı ve yenidoğan örneklerinde ise Hb A’nın hemen yanında (katodik tarafta) Hb F gözlenir. b-talasemi taşıyıcılarda Hb A₂ miktarı artmış olup bazı vakalarda Hb F miktarında görülür.

Orak hücre anemisi taşıyıcılarda Hb A yanısıra Hb A₂ ile Hb F arasında göç eden Hb S bandı görülür.  Hastalarda ise Hb A gözlenmez, bantların büyük kısmı Hb S olup  değişik oranda Hb F bulunmaktadır (şekil 18).

AH                  AH                      AF

AE    AE    AA    SE   AE     SF      AS        AS

 

                 Şekil 18: Selüloz asetat elektroforezi ile ayrıştırılan hemoglobinler

Alfa talasemi olgularında kordon kanı incelenmesinde Hb A’dan daha hızlı göç eden (daha anodik ) Hb Bart’s izlenir. Bu Hemoglobin 4g globin zincirinden oluşmuştur.  Yetişkin hastalarda ise 4b globin zincirden oluşan Hb H izlenebilir. Bu hemoglobinde (HbH) A’dan daha hızlı olup elektroforezde  HbA’nın önünde görülür. Kolayca denatüre olduğu için elektroforezde az miktarda veya bekletilmiş kan örneklerinde hiç görülmeyebilir.

Hb C ve Hb E selüloz asetat  elektroforezde Hb A₂ ile aynı yerde göç ederler. Hb S, Hb D, Hb G aynı yerde bant verirler. Hb S ile diğerlerinin ayrımı oraklaşma (sickling) testi ile basitce yapılabilir.

Anormal hemoglobinleri kesin ayırımı izoelektrofokusing ve HPLC ile yapılır. Unstable hemoglobin varyantları elektroforezde az veya hiç görülmeyebilir. Bu varyantlar DNA analizi ile belirlenir.

4.ORAKLAŞMA TESTİ

Prensip : Hemoglobin S içeren eritrositler oksijen eksikliğinde ve indirgen ajanlarla muamele edildiğinde orak şeklini alırlar.

Ayıraç : % 2 Sodyum metabisülfit (Na₂S₂O₅) : 2 g Sodyum metabisülfit bir miktar suda çüzülür ve 100 ml’ye tamamlanır.

Yöntem : Bir lam üzerine bir damla test edilecek kan ve kan üzerine 2-3 damla Sodyum metabisülfit konur. İyice karıştırılır, üzeri lamel ile kapatılır, etrafı hava ile temasını önleyecek bir madde (sedir yağı) ile kapatılır. Oda ısısında bırakılır, 15-30 dakika sonra mikroskopta oraklaşma gözlenebilir. Bazen oraklaşmayı görmek için 2 4 saat kadar beklemek gerekebilir.

5.İZOELEKTROFOKUSİNG (IEF)

Prensip:

Proteinler izoelektrik noktalarından (pI) faydalanılarak ayrıştrılabilmektedir. pH:6-8 arasında olan ve amfolin içeren agaroz veya poliakrilamid jel (0.5-1 mm kalınlıktaki) üzerine 5 cm aralıkla yerleştirilen anot ve katot solüsyonları ile bir pH gradienti oluşturulmaktadır. Numune katodik olarak uygulandıktan sonra  elektroforeze 1-2 saat devam ettirilir. Protein molekülleri bu jel üzerinde kendi izoelektrik noktalarına kadar göç etmektedirler. izoelektrik noktaları 0.01 pH ünitesi kadar farklılık gösteren Hb molekülleri dahi IEF ile kolayca ayrıştırılabilmektedir.

Yöntem için jel ve solüsyonlar hazırlanabileceği gibi hazır olarak kit halinde de (Isolab Inc. Akron OH veya Pharmacia LKB, Piscataway,NJ) temin edilebilmektedir.

Araç ve Çözeltiler

Ÿ       Güç kaynağı, 30 W (Pharmacia ECPS 3000/150)

Ÿ       Yatay elektroforez cihazı ve soğutucu tabla (Pharmacia)

Ÿ       Whatman I filtre kağıdı

Ÿ       Agaroz jel

Ÿ       Anod solüsyonu 0.5 M Glasial asetik asit

Ÿ       Katot solüsyonu 0.5 M ethanolamine +0.1 % KCN

Ÿ       Jel boyası:%0.55 o-dianisidine (methanol'de çözünmüş)

Ÿ       Boya tamponu: 0.5 M Sodyum sitrate pH: 4.4

Ÿ       Fixing solüsyonu: %10 TCA

Ÿ       Hidrojen Peroksid: %3

Ÿ       Elektrod şeritleri

Ÿ       Numune uygulama şablonu

Yöntem:

Hazır jel plaklar Watman-1 kağıdı  arasında kurulandıktan sonra distile su ile ıslatılmış tabla üzerine yerleştirilir. Kalın Whatman kağıdından kesilmiş bir şerit anot solüsyonu ile ıslatılarak jelin bir ucuna, diğeri ise katot solüsyonu ile ıslatılarak jelin öbür ucuna, numune uygulama kalıbı ise katodun önüne yerleştirilir. Her örnekten 3-4 μl hemolizat (25-30 μg Hb) jel üzerine aplike edilip 10-15 dakika beklenerek jele geçmesi sağlanır. Her 10 örnek arasına mutlaka kontrol (A,F,S,C) konulmalıdır. Uygulama kalıbı dikkatlice kaldırılarak elektrodların amfolitlerle  ıslatılmış şeritlere temas  etmesi sağlanır. Tabladan soğuk su (8-10°C) dolaşımı sağlanırken 30 W'lık akım 90 dakika süreyle uygulanır.     Elektroforezden sonra jel tabladan alınarak %10'luk TCA içerisinde 15 dakika tesbit edilir. Distile su ile bir kaç kez çalkalanan jel 30 dakika su içinde bırakılır. 20 ml boyama tamponuna 36 ml boya ilave edilerek saf su ile 200 ml'ye tamamlanır, üzerine 4 ml de H₂O₂ (%3) ilave edilir. Jel bu solüsyonda 15-20 dakika tutularak bantların belirlenmesi sağlanır. Jel tekrar distile su ile yıkanarak ışığa karşı okunur. Oda ısısında bir gece veya 65-70°C'de 75 dakika bırakılarak kurutulur. Kuru jel yıllarca saklanabilir. İstendiği zaman dansitometrede değerlendirilebilir (Şekil 19).

Yorum:

Bu yöntemin en büyük avantajı elektroforetik sistemlerde HbS ile aynı mobiliteye sahip olan hemoglobinlerin ayrıştırılabilmesidir. Selüloz asetat elektroforezi ile 70 hemoglobin varyantından 31 tanesi HbS den ayrıştırılamazken  bu yöntemle (IEF) her biri diğerinden kolayca ayrıştırılabildiği şekil 20’de gösterilmiştir.

    Protein boyası yerine, heme spesifik o-dianisidine kullanılması diğer proteinlerin elimine edilmesini sağlar. Filtre kağıdına emdirilerek toplanmış kan örnekleri, IEF'yle son derece doğru sonuçlar vermektedir.

Şekil 19: Hemoglobin varyantlarının izoelektrofokuslama ile ayrıştırılması

          Şekil 20: Hemoglobin varyantlarının izoelektrofokuslamadaki sıralaması

6.HEMOGLOBİN A₂ MİKTARININ BELİRLENMESİ

Prensip:

Anyon değiştirici reçineye HbA₂ bağlanarak diğer Hb'lerden ayrıştırılmaktadır. Bu mikrokromatografik yöntemde HbA₂ miktarını belirlemek için DE-52 reçinesi Glisin-KCN tamponu içerinde şişirilip bir pastör pipetine (0.5x7 cm) doldurulmaktadır. Kolona uygulanan hemolizattaki HbA₂, reçineden 18 mM NaCl içeren tampon ile alınırken HbA ise 200 mM NaCl tamponu ile kolondan alınmaktadır. Her iki bileşenin abzorbansı 415 nm de okunarak yüzde oranları hesaplanır.

Araç ve Çözeltiler

Ÿ       DE-52 (Dietil amino metil selüloz) Whatman.

Ÿ       Geliştirici A: 0.2 M Glisin, %0.1 KCN. 15 gr glisin ve 0.1 gr KCN bir miktar saf suda çözülür, sonra 1 litreye tamamlanır.

Ÿ       Geliştirici B: 0.2 M Glisin, 0.2 M NaCl, %0.01 KCN; 15 gr Glisin, 11.7 gr NaCl ve 0.1 gr KCN biraz saf suda çözülür, sonra litreye tamamlanır.

Ÿ       Geliştirici A-18: 0.2 M Glisin, %0.1 KCN, 0.018 M NaCl: 15 gr Glisin, 0.1 gr KCN ve 1 gr NaCl saf suda çözülerek litreye tamamlanır.

Yöntem:

Bir erlen içerisine yeterli miktarda DE-52 jeli konulup üzerine dört katı hacimde geliştirici A ilave edilir, 10 dakika mekanik karıştırıcıda karıştırılıp jelin çökmesi için beklenir. Bu işlem tamamlandıktan sonra üstteki sıvı atılır. İşlem en az üç kez tekrarlanıp pH değerinin 7.8 olması sağlanır. Bu karışım pastör pipeti içerisine doldurulur. Kolon üzerine taze hazırlanmış hemolizat tatbik edilir. Kolon 8 ml geliştirici A-18 ile yıkanarak HbA₂ toplanır. Sonra geliştirici B ile total hemoglobin fraksiyonu toplanır. Bu fraksiyonun hacmi B solüsyonuyla 25 ml'ye tamamlanır. Her iki fraksiyon da spektrofotometrede 415 nm'de suya karşı okunur.     Hesap;

                                     Absorbans A₂ x 100                   

  % HbA₂ = ---------------------------------------------------                                                 

                         Absorbans A₂ + Absorbans A x 3.3

Yorum :

Normal erişkinlerdeki HbA₂ miktarı %2.5±0.9 dur. Beta talasemi heterozigotlarda bu değer yaklaşık iki katına kadar artarken delisyona bağlı beta talasemilerde ise daha da fazla yükselmektedir. Buna karşın alfa talasemi vakalarında HbA₂ miktarı azalmaktadır. Bunun nedeni de azalan alfa zinciri delta ile daha sınırlı miktarda HbA₂ meydana getirmektedir. Bu yöntem HbS içeren örneklerde Hb A₂ ile bir miktar HbS’in birlikte elüe olması nedeniyle uygun değildir.

7. HbF TAYİNİ

Prensip:

Hemoglobinler içerisinde alkaliye karşı en dirençli olanı HbF'dir. Bu özelliğinden faydalanarak HbF miktarı belirlenebilmektedir. NaOH ile denatürasyondan sonra diğer Hb'ler amonyum sülfat ile çöktürülerek filtre kağıdından süzülür. HbF içeren berrak supernatant solüsyonun absorbansı 540 nm'de okunur. Fetal ve kontrol hemoglobin solüsyonunun optik dansitesi karşılaştırılarak HbF'in yüzdesi saptanır.

Araç ve Çözeltiler

Ÿ       Drabkin solüsyonu:1g Na₂CO₃, 0.052g KCN, 0.198g K₃Fe(CN)₆ saf suda çözülerek     hacmi l'ye tamamlanır.

Ÿ       1.2 N NaOH

Ÿ       Doymuş amonyum sülfat

Ÿ       Whatman I kağıdı

Ÿ       Test tüpü

Ÿ       Pipetler 1, 3 ve 10 ml

Ÿ       Spektrofotometre

Yöntem:

Ÿ       10 ml Drabkin solüsyonu içerisine 0.4-0.5 ml (6.5 g%) hemolizat konur. İyice karıştırılır.

Ÿ       Her tüpe 3 ml alınır, birisi test diğeri kontrol diye işaretlenir.

Ÿ       Test tüpüne 1,2 N NaOH'ten 0.2 ml konup çalkalanarak iki dakika beklenip üzerine 2 ml amonyum sülfat eklenerek reaksiyon durdurulur.

Ÿ       Beş dakika sonra Whatman-1 kağıdından filtre edilir.

Ÿ       Kontrol tüpüne 0.2 ml H₂O ve 2 ml Amonyum sülfat eklenerek karıştırıılır.

Ÿ       Kontrolden 1 ml alınarak 4 ml saf su eklenir (1/5 oranında seyrelir).

Ÿ       Test tüpü ile kontrol tüpünün abzorbsiyonu 540 nm'de okunarak aşağıdaki şekilde    HbF hesaplanır.

                  Test tüpünün O.D

Hesaplama: ------------------------- X 100 = %F

                  Kontrolün O.D. X 5

Yorum:

Erişkinlerdeki HbF ortalaması % 1'in altındadır. Anemilerde, lösemilerde ve karsinomalarda yükselmiş HbF seviyesi görülebilir. Orak hücre anemili erişkinlerde HbF seviyesi %15-20'ye kadar ulaşabilir.

8.YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ;

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPY ; HPLC

Hemoglobin ve globinlerin ayrıştırılması ve miktarlarının belirlenmesinde kullanılan yüksek basınçlı sıvı kromatografisi hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Zayıf iyon değiştirici kolonlar (anyon ve katyon değiştiriciler) Hb'lerin analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Globin zincirlerinin ayrıştırılması ve miktarlarının belirlenmesinde reverse faz HPLC'den faydalanılır. Bu yöntemde geniş çaplı dolgu maddesi içeren Vaydac C₄ kolonu kullanılmaktadır. Moleküllerin hidrofobik özelliklerinden faydalanılarak ayırım yapılmaktadır.

Yüksek basınçlı sıvı kromotografisini oluşturan önemli parçalar şunlardır:

Ÿ       İki adet pompa: Yüksek basınç sağlar (Waters 501 HPLC Pump)

Ÿ       Gradient kontrolör: İki farklı tamponun karışım oranını ve akış hızını kontrol eder (Waters 721)

Ÿ       Kolon: Basınca dayanması için çelikten yapılmış bir boru içerisine değişik kimyasal maddeler (anyon veya katyon değiştirici) doldurulmuştur.

Ÿ       İnjektör: Sisteme numune tatbik etmek için kullanılır.

Ÿ       Dedektör: Kolonda ayrıştırılan fraksiyonların absorbsiyonunu ölçer (Waters 484)

Ÿ       Recorder-integratör: Dedektörden gelen sinyalleri kaydeder ve her fraksiyonun yüzde değerlerini hesaplar (Waters 740 Data Module)

Ÿ       Tamponlar: Konsantrasyonları farklı ama pH'ları aynı iki çözelti kullanılır.

HPLC'de hemoglobin ve globin analizleri için farklı kolon ve tamponlar kullanılır. Ayrıştırılacak hemoglobinin özelliğine göre zayıf katyon veya anyon değiştirici kolonlar seçilir. Kullanılan kimyasal maddeler HPLC grade olmalıdır.

Katyon Değiştirici HPLC

Prensip:

Negatif olarak yüklenen Hb'ler kolona bağlanmazken  pozitif olarak yüklenenler kolonun yapısında bulunan katyon değiştirici gruplar (CM veya polyaspartate) tarafından bağlanırlar. Tamponun katyon konsantrasyonu (Na⁺ veya NH₄⁺) yavaş yavaş artırılarak pozitif yüklenen Hb'ler kolondan elüve edilirler (10,16,17). Bu analiz için HPLC sisteminde kullanılan kolon ve tamponlar şunlardır:

Ÿ       SynChropak CM-300 kolonu (CCM 103-25): Zayıf katyon değiştirici bir rezin ile doldurulmuş olup 4.1 x 250 mm ebadındadır.

Ÿ       Tampon A, pH 6.4 : 30 mM Bis-Tris, 1.5 mM KCN;

Ÿ       Tampon B, pH 6.4. : 30 mM Bis-Tris, 1.5 mM KCN, 150 mM sodyum asetat           

Yöntem:

Akış hızı dakikada 1 ml/dak olarak ayarlanır. Kolon %90 tampon A, %10 tampon B ile  (10 dakikada) dengelenir. 100-250 μg Hb (20-220 μl hemolizat) sisteme enjekte edilir. Tampon B'nin konsantrasyonu 90 dakika içerisinde %10'dan %90'a ulaşır. Beş dakika daha tampon B (%100) geçirilen sistem yeni örnek için hazır duruma gelir. Elüve edilen Hb'lerin 415 nm'de absorbansı ölçülerek grafikleri alınırken yüzde konsantrasyonları da belirlenir (şekil 21 ve 22)..

Yorum:

Metodun hassasiyeti bazı teşhisleri kolaylaştırır. Kordon kanı HPLC'de ayrıştırıldığında FAS, FSS ve FSβ⁺ thal kolayca teşhis edilebilir. Selüloz asetat elektroforezyle  ayrştırılamayan HbS; HbD ,HbG HbE'den, HbO-Arab ise HbC'den HPLC ile kolayca ayrıştırılmaktadır. HbC ve HbO-Arap'ın bulunduğu örneklerde HbA₂ miktarı doğru olarak tayin edilebilmekle birlikte HbA₂'den HbE'nin ayırımı mümkün değildir. HbA₂ miktarının tayini β-thal taşıyıcılarında önemli olup normal miktarının (%2.5±0.9) iki katına kadar %5 ulaşabilir. Alfa talasemilerde özellikle HbH, δβ talasemili erişkinlerle delesyona bağlı HPFH ve δ talasemi taşıyıcılarında HbA₂ miktarı azalmaktadır.

Şekil 21: Katyon değiştirici kolon ile HbF, HbA Ve HbA2 ayırımı

Şekil 22: Katyon değiştirici kolon ile HbF, HbA Ve HbA₂ ayırımı görülmektedir

Anyon Değiştirici HPLC

Prensip:

pH 8.3'de pozitif yüklü Hb'ler kolona bağlanmadan izole edilirken, negatif yüklüler kolona bağlandığı için artan anyon gradiyenti ile elüve edilirler. Bu yöntem özellikle yenidoğanlarda HbH ve HbBarts miktarını belirlemek için geliştirilmiştir. Bu analiz için HPLC'de kullanılan kolon ve tamponlar şunlardır:

SynChropak AX-300 (CA 105-10) kolonu zayıf bir anyon değiştirici rezin ile doldurulmuş olup 100x4.1 mm boyutlarındadır.

Tampon A pH: 8.3:  30 mM Tris 1.5 mM KCN;       

Tampon B pH: 8.3:  30 mM Tris 1.5 mM KCN 150 mM NaCl, 1.5 mM KCN

100-250 μg Hb aplike edilerek kromatogram aşağıdaki programa göre düzenlenir.

Akış Hızı 0.7 ml/min

T₁= 17 dak Tampon B %40 - %45

T₂= 15 dak Tampon B %45 - %95

T yıkama= 9 dak Tampon B %99

T denge= 10 dak Tampon A %60 + Tampon B %40

Bu kolonda hemoglobinler HbF-HbA₂ – HbS sırasına göre şekil 23’de gösterilmiştir.  

Şekil 23: Anyon değiştirici kolon ile HbF, HbA₂ ve HbS ayırımı görülmektedir.

Reverse faz HPLC ile globin zincir ayrımı:

Globin zincirleri elektroforez, kromotografi ve reverse faz HPLC yöntemleri ile ayrıştırılabilmektedir. Globin zincirlerinin (α, β, γ ve δ) ayrımı Hb varyantlarının belirlenmesinde önemli bilgiler vermektedir. Elektrik alanında farklı yüklenmeyen zincirler elektroforezle ayrıştırılamazlar (^Aγ ^Gγ, α ve β zincir varyantları). Son yıllarda yaygın olarak kullanılmaya başlayan reverse faz HPLC yöntemi ile bu ayrım mümkün olmuştur. HPLC'de kullanılan geniş porlu C₄ kolonu ile globin zincirleri ayrıştırılarak mutasyonlar belirlenebilmektedir.

Prensip:

Globin zincirleri hidrofobik özelliklerine göre ayrıştırılmaktadır. Polar globin zincirleri kolondan daha önce elüve olmaktadırlar.Globin zincirindeki mutasyon sonucu (polar ® apolar) hidrofobik özellik artırıyor ise kolondan daha geç elüve olmaktadır (10). Mutasyonun zincir üzerindeki yeri de elüsyonda rol oynamaktadır. ^Gγ ve ^Aγ zincirlerinde 136. pozisyonunda bulunan (Gly:G ve Ala:A) hidrofobik farklılıklarından dolayı ayrıştırılabilmektedirler.

Kolon ve Tamponlar:

Ÿ       Vydac C₄ (214 TP 54) geniş porlu kolon (330 A°; 250x4.6 mm).

Ÿ       Tampon A: % 20 Asetonitril %80 H₂O, %0.1 TFA

Ÿ       Tampon B: % 60 Asetonitril %40 H₂O, %0.1 TFA

Yöntem:

Kolona 100-200 μg Hb aplike edilir. Tampona eklenen TFA ile pH düşürülerek (pH:2.0) hem globinden ayrılır. Kolon, B tamponu ile 50 dakikada, %50'den %60'a değişecek şekilde (akış hızı 1 ml/dak) yıkanır.

Kolon temizlenirken 5' süreyle tampon B, dengelemek için 10 dakika süreyle %50 A+ %50 B ile yıkanır. Zeta zincirinin ayrıştırılması ve miktarı da istenirse ikinci bir gradient (tampon B'nin konsantrasyonu %60-78, 60 dakika süreyle) uygulanarak ayrıştırılabilir. Elüsyon piki şu sırayı takip eder: injeksiyon piki, hem, β,α,^Aγ^T, ^Gγ ve ^Aγ^I dır. Alfa ve beta pikleri arasında küçük bir delta piki gözlenir. Kordon kanı ve erişkinlerdeki gama zincir varyantlarının (^Gγ,^Aγ^I,^Aγ^T) miktarı doğru bir şekilde belirlenebilir. Ayrıca gama globin geninin üç veya dörde çıkması ve farklı tipteki HPFH ile β ve δβ talasemiler içinde önemli bilgiler elde edilebilir. Şekil 24’de reverse faz HPLC ile orak hücre anemili bir örnekte gama globin ayırımı görülmektedir.

Şekil 24: Reverse faz kolonu ile globin zincir ayırımı görülmektedir.

Yorum:

Bu yöntemin en büyük avantajı, iyon değiştirici kromotografi veya elektroforezle ayrıştırılamayan doğal substitüsyonlu varyantların belirlenebilmesidir. Bazı dayanıksız β zincir varyantları ve artmış O₂ affiniteli Hb'ler elektroforezle ayrıştırılamadığı halde reverse faz HPLC de zincir ayırımı ile tanımlanabilirler. Kordon kanında düşük seviyede bulunan zeta zinciri de bu metodla belirlenebilir. Şekil 25’de reverse faz HPLC ile gama varyantları ayrıştırılmıştır.

Şekil 25: Reverse faz kolonu ile globin zincir ayırımı görülmektedir.

GENEL TARTIŞMA

Anormal Hb ve talasemi gibi hastalıkları diğerlerinden ayırd edebilmek amacıyla kullandığımız Kan sayımı, hemolizat hazırlama, HbA_2, HbF ve elektroforez yöntemleri sırasıyla incelenerek avantajları tartışılmıştır. Bu sırayı izlediğimizde vakalarımızın çoğu çözümlenmekte veya hangi globin geni üzerinde mutasyonun bulunabileceği tahmin edilerek PCR temeline dayalı DNA yöntemleri ile moleküler defekt belirlenmektedir. DNA seviyesinde belirlenen taşıyıcılara ait hematolojik veriler tablo 23’de verilmiştir.

IEF’nin her rutin laboratuvarda bulunmadığı bir gerçek olup tartışmalarımıza ışık tutması ve çözümlenemeyen örneklerin bu yöntemin kullanıldığı laboratuvarlara gönderilerek teşhis edilmesini sağlamak amacıyla tartışmaya alınmiştır. HPLC artık giderek yaygınlaşan cihazlar arasında yerini almıştır. Talasemi ve anormal hemoglobin çalışan laboratuvarlar için özel dizayn edilmiş farklı üreticilerin ürünleri bulunmaktadır. Reverse faz HPLC ile globin zincir ayırımı yapılarak daha çok araştırma amaçlı olarak yararlanılmaktadır. Hemoglobin varyantlarının tanımı için, olası yeni bir anormal Hb’in teşhisinde bu yöntemden faydalanılmaktadır. Hem protein hemde DNA düzeyindeki farklı yöntemlerin iyi bilinmesi , meraklı ve deneyimli kişiler tarafından uygulanmasıyla mümkün olmaktadır. Elektroforez veya diğer yöntemlerle birazcık farklı bulunmasına rağmen kirlilik veya yöntem hatası olarak düşünülen ve keşfedilmeyi bekleyen Hb moleküllerinin olabileceğini her yıl dünya Hb listesine eklenen yeni varyantlar göstermektedir. 

Tablo 23: Anormal hemoglobin, alfa ve beta talasemi taşıyıcılarında hematolojik veriler.

*HbA₂ + HbE,   a^T nondelesyonel alfa talasemi mutasyonunu göstermektedir.

KAYNAKLAR

Huisman THJ, Carver MFH and Efremov GD.A Syllabus of Human Hemoglobin Variants I. Ed. 1996, II. Ed. 1998, Georgia USA.

Arcasoy A: Türkiye’de thalassemia taşıyıcı sıklığı ve anormal hemoglobinler. Ankara talasemi derneği, 1994.

Huisman THJ, Carver MFH and Baysal E. A Syllabus of Thalassemia Mutations. 1997, Georgia USA.

Huisman THJ: Hemoglobinopathies. Edinburg Churchill Livingstone USA, 1986. s 1-30.

Black J: Isoelectrofocusing in agarose jel for detection and identification of hemoglobin variants. Hemoglobin 8; 117-127, 1984.

Cossu G, Manca M, Pirastu MG, Bullitta R, Bossisio AB,           Giannazza E, Righetti PG: Neonatal screening of β-thalassemias by thin layer Isoelectric focusing. Am J Hematol 13: 149-157, 1982.

Galacteros F, Kleman K, Caburi-Martin J, Beuzard Y, Rosa J, Lubin B: Cord blood screening for hemoglobin abnormalities by thin layer isoelectrofocusing. Blood 56: 1068-1071, 1980.

Righetti PG, Gianazza E, Bianchi-Bossisio A, Cassu G:             Convertional isoelectric focusing and immobilized pH gradients for hemoglobin separation and identification. (Ed.) Huisman THJ: The hemoglobinopathies (Methods in Hematology. Vol 15), içinde. Churchill Livingstone, Edinburgh, 1986. s 47-70.

Baset P, Beuzard Y, Garel MC Rosaj: Isoelectrofocusing of human hemoglobin. Its application to screening to the charecterization of 70 variants and to the study of modified fractions of normal hemoglobins. Blood 51: 971-982, 1978.

Kutlar A, Huisman THJ: Detection of Hemoglobinopathies in Techniques. (Ed.) Homes GA: Diagnostic Human Biochemical Genetics A Laboratorty Manuel. Wiley and Sons Inc, New York, 1991. s 519-560.

Huisman THJ, Schroeder WA, Brodie AN, Mayson M, Jakway J: Microchromotography of hemoglobins III. A simplified procedure for the determination of hemoglobin A_2. J Lab Clin Med 86: 700-702, 1975.

Condrington JF, Li H-W, Kutlar F, Gu LH, Ramachandron M, Huisman THJ: Observations on the levels of the HbA₂ in patients with different β-thalas-semia mutations and a δ chain variant. Blood 76: 1246-1249, 1990.

Weatheral DJ and Clegg JB: The Thalassemia Syndromes. 3.baskì Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1981.

Betke K, Marti HR, Schlicht I: Estimation of small percentages of fetal hemoglobin. Nature 184: 1877-1878, 1959.

Kutlar A, Kutlar F, Gu L-G, Mayson SM, Huisman THJ: Fetal hemoglobin in normal adults and β-thalassemia heterozygotes. Hum Genet 85: 106-110, 1990.

Wilson JB, Headlee ME, Huisman THJ: A new high performance liquid chromatographic procedure for the separation and quantitation of various hemoglobin variants in adult and newborn babies. J Lab Clin Med 102: 174-186, 1983.

Kutlar A, Kutlar F, Wilson JB, Headlee MG, Huisman THJ: Quantitation of hemoglobin components by high performance chain-exchange liquid chromatography; its use in diagnosis and in the assessment of cellular distrubition of hemoglobin variants. Am J Haematol 17: 39-53, 1984.

Kutlar F, Gu LH, Hu H, Huisman THJ: Quantitation of Hb Bart's, HbH, Hb Portland I, Hb Portland II and Hb Costant Spring by anion exchange high performance liquid chromatography. J Chromatogr 487: 265-274, 1989.

Bisse E, Wieland H: High performance liquid chromatographic separation of human hemoglobins; simultaneous quantitations of fetal and glycated hemoglobin. J Chromatogr 434: 95-110, 1988.

Kutlar F, Kutlar A, Huisman THJ: Separation of normal and abnormal hemoglabin chains by reversed phase high performance liquid chromatography. J Chromatogr 357:147-153, 1986.

Shelton JB, Shelton JR, Schroeder WA. High performence liquid  chromatographic separation of globin chains on a large pore C₄ column. J Liq Chromatogr 7: 1969-1977, 1984.

Çürük MA, Dimovski AJ, Baysal E, Gu L-H, Kutlar F, Molchanova TP, Webber BB, Altay Ç, Gürgey A and Huisman THJ: Hb Adana or a₂59 (E8) Gly®Aspb₂, A severly unstable a₁-globin variant, observed in combination with the –(a) 20.5 kb a-thal-1 deletion in two Turkish patients. A J Hematol 44:270-275, 1993.

Yüregir GT, Donma O, Dikmen N, İspir T and Çınar M:Population studies of hemoglobin S and other variants in Çukurova. The southern part of Turkey. Acta Haematol 50:757-765,1987